一、器材與試劑：

　　干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

　　具體步驟：

　?。?）水的制備：

　　細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.

　?。?）PBS的制備與消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：

　　1.溶解定容：將藥品（NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4·H2O1.56g，KH2PO40.2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

　　2.移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。

　?。?）胰蛋白酶溶液的配制與消毒：

　　胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力zui強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。

　　1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內過夜。

　　2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

　?。?）青、鏈霉素溶液的配制于消毒

　　1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

　　2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。

　　3.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度zui終為100單位/ml。1單位＝1微克

　?。?）RPMI1640的制備與消毒：

　　1.溶解、調PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中）,充分攪拌至粉劑全部溶解,并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度zui終各為100單位/ml。然后用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。zui后定容至1000ml，搖勻。

　　2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

　　3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。

　　4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內置于4℃冰箱內待用。

　　5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。

　?。?）血清的滅活：

　　細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

　　（7）HEPES溶液：

　　HEPES的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanicacid）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內含20mmol/LHEPES即可達到緩沖能力。

　　1mol/LHEPE緩沖液配制方法如下：

　　準確稱取HEPTS238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4℃保存。

　　注意：因為現(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內HEPES的終濃度仍然為20mmol/L。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可*（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。

　?。?）谷氨酰胺：

　　合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。

　　一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。

　?。?）肝素溶液的配制：

　　含有肝素的培養(yǎng)液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中zui終濃度為50ug/ml。因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為­­℃。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（可加入0.9ml）即可。

　?。?0）Ⅰ型膠原酶：

　　0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

　?。?1）明膠溶液：

　　因為明膠難于過濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1%的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

　?。?2）其他培養(yǎng)用液的配制：

　　20ug/ml內皮生長因子，

　　注意事項：

　　1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

　　2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

　　3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值zui終為7.2，可在配制時調PH至7.4。

　　五.細胞傳代培養(yǎng)（消化法）

　　具體操作：

　?。?）傳代前準備：

　　1.預熱培養(yǎng)用液：把已經配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。

　　2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。

　　3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。

　　4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。

　　5.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。

　　6.取出預熱好的培養(yǎng)用液：取出已經預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。

　　7.從培養(yǎng)箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。

　　8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

　?。?）胰蛋白酶消化；

　　1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞，*消化溫度是37℃。

　　2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

　　3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。

　?。?）吹打分散細胞：

　　1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。

　　2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。

　　3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心6～8分鐘。

　　4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。

　　（4）分裝稀釋細胞：

　　1.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。

　　2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。zui后要做好標記。

　?。?）繼續(xù)培養(yǎng)：

　　用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。

　　傳代細胞培養(yǎng)注意事項：

　　1.嚴格的無菌操作

　　2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。

　　附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：

　　EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節(jié)PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要*清洗，否則再培養(yǎng)時細胞容易脫壁。

　　六.細胞的復蘇

　　細胞復蘇的原則－快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

　　具體操作

　　（1）實驗前準備：

　　1.將水浴鍋預熱至37℃

　　2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

　　3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。

　?。?）取出凍存管：

　　1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

　　2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

　　（3）迅速解凍：

　　1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

　　2.約1-2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

　?。?）平衡離心：

　　用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3min

　?。?）制備細胞懸液：

　　1.吸棄上清液。

　　2.向離心管內加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。

　?。?）細胞計數(shù)：

　　細胞濃度以5×105/ml為宜。

　?。?）培養(yǎng)細胞

　　將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。

　　初學者易犯錯誤：

　　1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

　　2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

　　3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

　　4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。