胚胎干細胞能在體外維持未分化狀態(tài)與正常核型、具有無限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合體,可分化為來自三個胚層的各種細胞類型。ES細胞被廣泛應用于生產轉基因動物和克隆動物,構建醫(yī)學動物模型,研究人類基因功能。利用ES細胞可研究真核細胞的基因表達和調控,尋求細胞分化和細胞修復的機制,研究細胞、組織、器官移植。ES細胞的研究應用已成為生命科學的熱點之一。目前哺乳動物ES細胞建系仍存在著品種單一、建系效率低等許多問題,嚴重影響了ES細胞的研究與應用。本研究比較了不同種屬、胚齡、取材、分離、傳代方法及消化液、培養(yǎng)液對ES細胞分離培養(yǎng)的效果,對影響ES細胞分離建系的各種因素進行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES細胞的建系方法,提高建系效率。建立了一種不經類胚體階段直接誘導小鼠EG細胞定向分化為神經細胞的方法,為小鼠EG細胞向神經細胞的體外分化研究提供參考。 1.采用分離5日齡小鼠胚胎外胚層進行昆明小鼠ES細胞分離培養(yǎng),與傳統(tǒng)分離ICM的方法相比顯著提高了昆明小鼠ES細胞的建系效率（12%&3.3%）;大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液與添加10ng/mL LIF的ES培養(yǎng)液相比,使分離ICM的胚胎傳至F1代的比例顯著提高（52%&36%）,傳至F2代的比例極顯著提高（40%&16%）;采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液連續(xù)消化法進行ES細胞分離傳代,ICM形成ES細胞克隆的比例提高到50%,ICM獲得傳至第5代的ES細胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES細胞分離時在胚胎貼壁率、ICM貼壁率、F1和F2代ES細胞出現(xiàn)率上無顯著差異;用絲裂霉素C處理MEF 1h適合作為ES細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層,添加10ng/mL LIF的ES培養(yǎng)液能有效抑制昆明小鼠ES細胞的分化。證實用改進的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES細胞系。 2.從11.5～12.5日齡昆明小鼠胚胎生殖嵴分離培養(yǎng)PGCs,獲得了能連續(xù)傳9～11代的EG細胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速貼壁法、與胎兒成纖維細胞共培養(yǎng)法分離PGCs,獲得了較多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG細胞集落百分率顯著高于穿刺生殖嵴和取胎兒后1/3部位組織（21%、30%&7%、16%）;2株EG細胞系傳代達到11～13代,在第10代時檢測AKP呈陽性,第5代時在體外可分化為多種細胞。 3.對兔囊胚進行蛋白酶消化和機械切割分離出ICM,在MEF飼養(yǎng)層培養(yǎng),提高了ICM的貼壁率（60%）,獲得了較多的ES細胞集落,而用全胚或離散胚培養(yǎng)不能獲得可傳代培養(yǎng)的兔類ES細胞集落;應用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液提高了ICM貼壁率（59%）,能有效抑制兔類ES細胞的分化。證實了經胚胎切割分離兔囊胚ICM在MEF飼養(yǎng)層上用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng),能有效地建立兔類ES細胞系。 4.從14～18天兔胚胎生殖嵴及其周圍組織分離PGCs的過程中,用酶消化液加機械吹打,能獲得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液進行兔類EG細胞分離與傳代,所得到的EG細胞集落多,傳代數(shù)高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA濃度消化液組;采用兔PGCs與同源胎兒組織成纖維細胞共培養(yǎng)適合兔類EG細胞分離培養(yǎng),將兔類EG細胞克隆與成纖維細胞飼養(yǎng)層一起消化進行傳代,獲得了能連續(xù)傳代的兔類EG細胞系。 5.對5～13周齡牛胎兒生殖嵴分離PGCs時,用percoll液離心和差速貼壁法純化PGCs,與穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落數(shù)無差別,但前者后期培養(yǎng)中EG細胞傳代數(shù)高于后兩種方法（13, 7 & 5, 3）;大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液用于牛EG細胞培養(yǎng)時,所得PGCs集落數(shù)和EG細胞傳代數(shù)高于添加LIF的EG細胞培養(yǎng)液組（13&7）;牛胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層可支持牛EG細胞的增殖,并能有效抑制分化;冷凍保存不影響牛PGCs和EG細胞的活力;體外分化試驗和AKP染色證實了所分離的牛EG細胞具有多能性。證實了對牛PGCs進行純化后在牛胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上用大鼠心肌細胞條件培養(yǎng)液進行培養(yǎng)能有效地建立牛EG細胞系。 6.用不經過類胚體階段的誘導分化方法,對小鼠EG細胞在老化飼養(yǎng)層上長期培養(yǎng)使其達到高密度起動了EG細胞的神經分化,獲得了較高比例的神經細胞樣集落（62.9%（78/124））,用RA進一步進行誘導可產生TH+陽性神經元細胞。經檢測EG細胞源神經細胞樣集落外層細胞以及從集落中遷出的細長細胞均表達神經前體細胞標志nestin,應用高濃度的RA對神經細胞樣克隆誘導,可獲得2.3±0.2%的TH+神經元細胞。應用不同濃度的RA對離散后的神經細胞樣集落進行誘導,TH+陽性細胞的比例在一定范圍內隨著RA濃度升高和分化時間的延長而上升;對EG細胞源神經前體細胞進行冷凍保存,解凍后細胞存活率83.2%,繼續(xù)培養(yǎng)仍具有增殖和分化能力,冷凍不影響EG源神經前體細胞的活力。在不更換飼養(yǎng)層連續(xù)增殖達到高密度的情況下培養(yǎng)小鼠EG細胞,建立了一種簡單而有效的小鼠EG細胞體外分化為神經細胞的培養(yǎng)體系,能有效產生TH+神經細胞。